<p>Pichia pastoris es una levadura metilotrófica ampliamente utilizada como sistema de expresión de proteínas heterólogas, bajo el control del promotor de la enzima alcohol oxidasa (pAOX1), el cual es inducible por metanol. Se han desarrollado un gran número de estrategias de cultivo que involucran la manipulación de parámetros operacionales para aumentar la producción de la proteína de estudio. En este trabajo se expresó la proteína lipasa proveniente del hongo Rhizopus oryzae (ROL), y se determinaron condiciones operacionales que maximizaran su productividad.Como punto de partida de esta investigación, se dispuso de un conjunto de datos obtenidos de un trabajo experimental realizado en la Escuela de Ingeniería Bioquímica bajo el marco del proyecto FONDECYT N°11110486 el año 2013. Este trabajo consistió en un diseño experimental central compuesto por 20 cultivos continuos de Pichia pastoris, en los que se evalúo el efecto simultáneo de tres variables operacionales: tasa de dilución, temperatura y velocidad de agitación, sobre la productividad volumétrica y específica de ROL. El análisis de los datos generados en aquel trabajo se llevó a cabo utilizando el Método de Superficies de Respuesta, el cual permitió interrelacionar las variables, definiéndose así, un rango de condiciones operacionales que maximizan la producción de ROL. Este rango de condiciones corresponde a tasas de dilución comprendidas entre 0.045-0.07 [h-1], temperaturas comprendidas entre 25-30 [°C] y velocidades de agitación comprendidas entre 500-700 [rpm]. Además, se obtuvieron los polinomios cuadráticos que describen el comportamiento de la productividad volumétrica y específica de ROL. Se buscó la solución a estos polinomios mediante métodos numéricos, determinándose que ambas productividades se maximizaban a 0.07 [h-1], 30 [°C] y 700 [rpm]. En la etapa experimental, se evaluaron tres condiciones operacionales comprendidas en estos rangos bajo modalidad de cultivo continuo (incluida la solución), y se determinó que la condición con la que se obtenían las mayores productividades era una tasa de dilución de 0.07 [h-1], una temperatura de 30 [°C] y una velocidad de agitación de 700 [rpm], obteniéndose una productividad volumétrica de ROL de 2.1 [UI/L h] y una productividad específica de ROL de 0.655 [UI/g biomasa h]. En la última etapa experimental, se evaluó esta condición bajo la modalidad de cultivo por lote alimentado con régimen de alimentación exponencial (considerando que la velocidad específica de crecimiento a controlar era 0.07 [h-1]). El medio utilizado fue una mezcla de glicerol y metanol, en distinta proporción de concentración. En el primer cultivo desarrollado se utilizó un 40% de glicerol y un 60% de metanol, y en el segundo cultivo se utilizó un 60% de glicerol y un 40% de metanol. En ambos cultivos se planteó un diseño de la alimentación exponencial, mediante una función escalonada de flujos, que permitió incrementar el volumen aportado al reactor en el tiempo; y de esta forma, se mantuvo controlada la velocidad específica de crecimiento. Los resultados obtenidos señalan que la productividad volumétrica y específica de ROL promedio final para el término del primer cultivo fue de 1.67 [UI/L h] y 0.19 [UI/g biomasa h], respectivamente. En el caso del segundo cultivo fue de 1.89 [UI/L h] y 0.18 [UI/g biomasa h], respectivamente. No obstante, estas productividades específicas son similares, la estrategia de cultivo por lote alimentado que permite obtener la mayor productividad volumétrica de ROL y mantener la concentración de metanol en el medio bajo el límite de la inhibición del crecimiento, es aquella en la que se utiliza un régimen de alimentación exponencial de una mezcla de 60% de glicerol y 40% de metanol en términos de concentración, a una temperatura de 30 [°C], velocidad de agitación de 700 [rpm] y una velocidad específica de crecimiento de 0.07 [h-1]</p>
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Licenciado en Ciencias de la Ingeniería
Ingeniero Civil Bioquímicotítulo
INGENIERIA CIVIL BIOQUIMICA
<p>Pichia pastoris es una levadura metilotrófica ampliamente utilizada como sistema de expresión de proteínas heterólogas, bajo el control del promotor de la enzima alcohol oxidasa (pAOX1), el cual es inducible por metanol. Se han desarrollado un gran número de estrategias de cultivo que involucran la manipulación de parámetros operacionales para aumentar la producción de la proteína de estudio. En este trabajo se expresó la proteína lipasa proveniente del hongo Rhizopus oryzae (ROL), y se determinaron condiciones operacionales que maximizaran su productividad.Como punto de partida de esta investigación, se dispuso de un conjunto de datos obtenidos de un trabajo experimental realizado en la Escuela de Ingeniería Bioquímica bajo el marco del proyecto FONDECYT N°11110486 el año 2013. Este trabajo consistió en un diseño experimental central compuesto por 20 cultivos continuos de Pichia pastoris, en los que se evalúo el efecto simultáneo de tres variables operacionales: tasa de dilución, temperatura y velocidad de agitación, sobre la productividad volumétrica y específica de ROL. El análisis de los datos generados en aquel trabajo se llevó a cabo utilizando el Método de Superficies de Respuesta, el cual permitió interrelacionar las variables, definiéndose así, un rango de condiciones operacionales que maximizan la producción de ROL. Este rango de condiciones corresponde a tasas de dilución comprendidas entre 0.045-0.07 [h-1], temperaturas comprendidas entre 25-30 [°C] y velocidades de agitación comprendidas entre 500-700 [rpm]. Además, se obtuvieron los polinomios cuadráticos que describen el comportamiento de la productividad volumétrica y específica de ROL. Se buscó la solución a estos polinomios mediante métodos numéricos, determinándose que ambas productividades se maximizaban a 0.07 [h-1], 30 [°C] y 700 [rpm]. En la etapa experimental, se evaluaron tres condiciones operacionales comprendidas en estos rangos bajo modalidad de cultivo continuo (incluida la solución), y se determinó que la condición con la que se obtenían las mayores productividades era una tasa de dilución de 0.07 [h-1], una temperatura de 30 [°C] y una velocidad de agitación de 700 [rpm], obteniéndose una productividad volumétrica de ROL de 2.1 [UI/L h] y una productividad específica de ROL de 0.655 [UI/g biomasa h]. En la última etapa experimental, se evaluó esta condición bajo la modalidad de cultivo por lote alimentado con régimen de alimentación exponencial (considerando que la velocidad específica de crecimiento a controlar era 0.07 [h-1]). El medio utilizado fue una mezcla de glicerol y metanol, en distinta proporción de concentración. En el primer cultivo desarrollado se utilizó un 40% de glicerol y un 60% de metanol, y en el segundo cultivo se utilizó un 60% de glicerol y un 40% de metanol. En ambos cultivos se planteó un diseño de la alimentación exponencial, mediante una función escalonada de flujos, que permitió incrementar el volumen aportado al reactor en el tiempo; y de esta forma, se mantuvo controlada la velocidad específica de crecimiento. Los resultados obtenidos señalan que la productividad volumétrica y específica de ROL promedio final para el término del primer cultivo fue de 1.67 [UI/L h] y 0.19 [UI/g biomasa h], respectivamente. En el caso del segundo cultivo fue de 1.89 [UI/L h] y 0.18 [UI/g biomasa h], respectivamente. No obstante, estas productividades específicas son similares, la estrategia de cultivo por lote alimentado que permite obtener la mayor productividad volumétrica de ROL y mantener la concentración de metanol en el medio bajo el límite de la inhibición del crecimiento, es aquella en la que se utiliza un régimen de alimentación exponencial de una mezcla de 60% de glicerol y 40% de metanol en términos de concentración, a una temperatura de 30 [°C], velocidad de agitación de 700 [rpm] y una velocidad específica de crecimiento de 0.07 [h-1]</p>
